非洲猪瘟病毒实时荧光pcr检测方法
1、范围
本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光pcr检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。
本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。
2、规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb 19489 实验室 生物安全通用要求
ny/t 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3、试剂
3.1 dna提取试剂
dna提取试剂的配制见附录a，或选取商品化的病毒dna提取试剂盒并参照说明书进行dna提取。
3.2 2 × pcr缓冲液
2 × pcr缓冲液的配制见附录a。
3.3 引物探针
3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒vp72基因（核苷酸序列见附录b）的引物及探针：
上游引物asf-cadc-rpcrf：5'-1528-atagagatacagctcttccag-1548-3'
下游引物asf-cadc-rpcrr：5'-1660-gtatgtaagagctgcagaac-1679-3'
荧光探针asf-cadc-probe：5'-1638-fam-tatcgataagattgat-mgb-1653-3'
3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（oie）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（manual of diagnostic tests andvaccines for terrestrial animals）第2.8.1章african swine fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：
上游引物asf-oie-rpcrf：5'-1627-ctgctcatggtatcaatcttatcga-1651-3'
下游引物asf-oie-rpcrr：
5'-1857-gataccacaagatcrgccgt-1876-3'
荧光探针asf-oie-probe：
5'-1761-fam-ccacgggaggaataccaacccagtg-tamra-1785-3'
3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。
3.4 阴性及阳性对照
阴性及阳性对照的制备方法见附录c。
3.5 其他试剂
消毒液、5u/μltaq dna聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/l pbs（ph7.2）。
消毒液配制见附录a， 0.01mol/l pbs配制见附录a。
4、仪器和耗材
分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光pcr仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μl，20 μl，200μl，1 000 μl）、1.5ml离心管（无核酸酶）。
5、操作步骤
5.1 样品采集及运输
样品采集及运输按照ny/t541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。
5.2 样品处理
检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1ml的0.01mol/l pbs（ph7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2min取上清；全血、血清样品直接取1ml，置于1.5 ml离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。
5.3 样品保存
采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。
5.4 病毒dna提取
5.4.1 dna提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒dna提取试剂，则按照试剂说明书操作。
5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 ml离心管，逐管编号。
5.4.3 每管加入200μl dna提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μl，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。dna提取液1见附录a。
5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μl dna提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。dna提取液2见附录a。
5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。
5.4.6 加入90μl无dna酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的dna，-20℃保存备用。无dna酶的灭菌去离子水见附录a。
5.5 实时荧光pcr操作
5.5.1 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2～5.5.4。
5.5.2 每个检测反应体系需使用20μl实时荧光pcr反应液。根据5.4.2中设定的n值，按附录d配制反应液，充分混匀后分装，每个pcr反应管20μl。转移pcr反应管至样品制备区。
5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入5.4中提取的dna溶液5μl，使每管总体积达到25 μl，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。
5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入实时荧光pcr检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（fam）作为报告基团，小沟结合物（mgb）为淬灭基团，反应参数设置如下：预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环；在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的ct值和荧光曲线判定结果。
6、结果判定
6.1 结果分析条件设定
实时荧光pcr检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为ct值。
6.2 结果描述及判定
当阳性对照ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录e。当被检样品出现典型的扩增曲线且ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；被检样品无ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。
7、实验室生物安全要求
7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见gb 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。
7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。
一附录 a (规范性附录) 试剂的配制
a.1 dna提取液1
peg8000晶体20.74g，nacl17.53g，加去离子水定容到100 ml。
a.2 dna提取液2
1mol/ltris.hcl 2 ml，2 mol/l kcl5 ml，0.5 mol/l edta 0.5 ml，np-40 1 ml，加去离子水定容到100 ml。
即kcl14.912g，tris碱12.114g，1.2068 ml浓hcl，edta14.612g，naoh 6g, 加去离子水定容到100 ml。
a.3 2×pcr缓冲液
灭菌去离子水 70 ml
三羟甲基氨基甲烷（tri s） 0.79 g
氯化钾 1.865 g
曲拉通x-100 0.5 ml
datp (100mmol/l) 2.5 ml
dttp (100mmol/l) 2.5 ml
dgtp (100mmol/l) 2.5 ml
dctp (100mmol/l) 2.5 ml
六水氯化镁 0.61 g
盐酸 调ph至9.0
灭菌去离子水 加至100 ml
a.4 消毒液
8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。
a.5 磷酸盐缓冲液（pbs）的配方
a.5.1 a液
0.2mol/l磷酸二氢钠水溶液：nah2po4·h2o 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 ml。
a.5.2 b液
0.2mol/l磷酸氢二钠水溶液：na2hpo4·7h2o 53.6 g（或na2hpo4·12h2o 71.6 g或na2hpo4·2h2o 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 ml。
a.5.3 0.01 mol/l、ph 7.2 磷酸盐缓冲液（pbs）的配制
取a液14 ml、b液36 ml，加nacl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 ml。经过滤除菌后，无菌条件下分装。
a.6 无dna酶的灭菌去离子水
无dna酶的灭菌去离子水是用1 %depc处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mω。
三
附录c（规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照
c.1阳性对照
阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒vp72基因片段，序列参见附录b，将vp72基因连接于pmd20-t载体制成阳性质粒pmd20-t-vp72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/l，保存于-20℃备用。
c.2 阴性对照
阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。
四
附录d（规范性附录）实时荧光pcr反应液配方
实时荧光pcr反应液配方见表d.1。
表d.1 实时荧光pcr反应液配方
组 分
1个检测体系的加入量
2×pcr 缓冲液a
12.5μl
dntp（2.5 mmol/l）
1.0 μl
上游引物（10 μmol/l）
1.0 μl
下游引物（10 μmol/l）
1.0μl
探针（10 μmol/l）
1.0 μl
taq 酶b（5u/μl）
0.5μl
去离子水
3μl
总体积
20μl
2×pcr 缓冲液a: 参见附录a.1配方。
taq 酶b：具有5’→3’外切活性。
五
附录 e（资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光pcr扩增实例参考
图d.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光pcr扩增实例。